Question

近年来，科学家利用基因工程技术创造出许多优良品种或产品。下图为获得抗除草剂转基因玉米的技术路线，其中含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K呈现蓝色。请回答以下问题：

（1）获得抗除草剂转基因玉米的过程中核心步骤是______________。

（2）为防止酶切产物自身环化，需使用______________种限制酶，分别对含除草剂抗性基因G的DNA片段和Ti-质粒上的_______________（填“报告基因”、“T-DNA”、“氨苄青霉素抗性基因”）进行酶切。

（3）为提高转化成功率，常用含______________的溶液处理土壤农杆菌，使其成为感受态细胞。转化成功的农杆菌应在含_________________的培养基上进行筛选1。

（4）农杆菌细胞内“报告基因”表达后______________（填“能”或“不能”）能催化无色物质K呈现蓝色，原因是_____________________________。

（5）农杆菌转化愈伤组织的过程中，愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。所以进行过程筛选2时，应在培养基中加入____，并挑选_______________的植物细胞，进行______________获得抗除草剂转基因玉米幼苗。

Answer

基因表达载体构建 2 T-DNA Ca2+ 氨苄青霉素 不能 报告基因中的内含子转录产生的RNA序列在农杆菌中不能被切除，导致农杆菌内“报告基因”翻译的蛋白质结构不同，不具相应的酶活性，无法催化无色物质K呈现蓝色 除草剂和物质K 愈伤组织细胞内呈显蓝色 植物组织培养

【解析】

基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）获得抗除草剂转基因玉米采用的是基因工程技术，该技术的核心步骤是基因表达载体构建。

（2）为防止酶切产物自身环化，需使用2种限制酶，分别对含除草剂抗性基因G的DNA片段和Ti-质粒上的T-DNA进行酶切（农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上）。

（3）将目的基因导入微生物细胞时，需要用Ca2+处理土壤农杆菌，使其成为感受态细胞。由图可知，标记基因是氨苄青霉素抗性基因，因此转化成功的农杆菌应在含氨苄青霉素的培养基上进行筛选1。

（4）含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达，其产物能催化无色物质K呈现蓝色，而农杆菌是原核生物，报告基因中的内含子转录产生的RNA序列在农杆菌中不能被切除，导致农杆菌内“报告基因”翻译的蛋白质结构不同，不具相应的酶活性，无法催化无色物质K呈现蓝色，因此农杆菌细胞内“报告基因”不能正确表达，其表达后不能催化无色物质K呈现蓝色。

（5）农杆菌转化愈伤组织的过程中，愈伤组织表面常残留农杆菌，会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。又由于农杆菌细胞内“报告基因”不能正确表达，其表达后不能催化无色物质K呈现蓝色，所以进行过程筛选2时，应在培养基中加入除草剂和物质K，并挑选愈伤组织细胞内呈显蓝色的植物细胞，进行植物组织培养获得抗除草剂转基因玉米幼苗。